参数规格：

产品名称：转基因构建FMV启动子-PVY基因PCR试剂盒说明书

货号：LZR86146

产品规格：50次

产品运输：低温运输

产品保存：-20℃保存

产品有效期：一年

产品特点：

产品仅用于科研本产品就是根据保守区设计引物而开发的高灵敏 PCR检测试剂盒 。

产品特点：

◇高特异性：与其他病毒无交叉反应，无非特异性扩增；

◇高灵敏度：检测灵敏度可达10~100拷贝；

◇操作简便：该系列所有试剂均采用相同的体系和条件，可同时进行多个检测；

◇高通量：多种双重PCR检测以及三重PCR检测试剂盒。

需要注意：

PCR反应液请在冰中配制，然后置于PCR反应仪上进行PCR反应。这种冷启动法（Cool Start Method）与热启动法（Hot Start Method）相结合，更能有效地减少PCR过程中的非特异性反应，增强PCR扩增的特异性，能得到良好的PCR结果。

PCR的反应条件：

因扩增片段的大小、反应体积、使用扩增仪器的不同而不同。

◇ 循环次数

根据模板DNA的量以及扩增片段的大小，设定25～30个循环。

如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，则会出现Smear。

◇ Anneal以及Extension

合适的Anneal温度通常在45～68℃之间 (预备实验可2℃间隔进行)。另外，由于在60～68℃间，也有很高的活性, 因此可在此温度范围内设定Anneal-Extension温度, 进行2 Step PCR。Anneal-Extension温度为68℃ 时，每kbp大体可设定30秒～1分钟；当温度设定在68℃以下时, 时间设定可稍长一些。通常，Anneal温度太高，有时会得不到扩增产物；Anneal温度太低时，容易发生非特异性反应。另外，Extension时间太短时，会得不到扩增产物或者会有一些短的非特异性产物优成；而Extension时间太长时，会出现Smear。

使用方法

一、样品 DNA 的制备

1.用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒DNAout。

2.如果有 N 个样品，则需要做 N+2 个提取，包括一个阳性对照和一个阴性对照。阳性对照是在 200μL 水中加 10μL PCR 阳性对照作为阳性对照，阴性对照是直接用 200μL 水作为阴性对照。提取结束后，*得到 200μL 模板 DNA（每个样品）放冰上待用，溶解 DNA 沉淀的溶液不能少于 200μL，否则PCR 抑制物很可能会抑制 PCR。二、PCR（60 μL 体系）

3.样品管：在 N+2 个PCR 管中加入下列成分：成分 N 个样品管 阴性对照 阳性对照PCR MagicMix 3.0 各 20 μL 20 μL 20 μL PCR 引物对 各 2 μL 2 μL 2 μL 样品 DNA 模板 各 18 μL - - 阳性对照（纯化后） - 18 μL - 阴性对照（纯化后） - - 18 μL电泳检测

4.取 10-20 μL PCR 产物直接进行琼脂糖凝胶电泳（本产品不需要单独加loading buffer），使用 100 bp DNA Marker，如果样品为阳性，将会得到长度为 3582 bp 的扩增产物。

二反应的准备： 　　

待各组份融化后先瞬时离心，然后轻弹混匀。按下表在已灭菌的PCR管中配制反应体系，每次实验需加一个阴性和一个阳性对照，测试反应管可以有多个。配制过程中应注意无菌，戴口罩，并注意避免操作产生的气溶胶造成样品间的交叉污染，推荐在有风压的设备如超净台或生物安全柜中进行操作。建议配制完毕后瞬时离心以使液体沉至管底。 　　

三、PCR反应： 　　

降落PCR法(Touchdown PCR)：94℃变性2分钟;首循环：94℃变性30秒，68℃退火30秒，72℃延伸45秒;从八个循环开始，每循环退火温度下降1℃，其余不变;从第九个循环开始，反应条件固定为：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸45秒，循环32次;循环结束后，在72℃延伸7分钟，*保持在4℃。

5水杨二水　含量：≥ 98%　规格：20 mg/支

5Sulfosalicylic acid, dihydrate　含量：≥ 98%　规格：20 mg/支

6苄氨嘌呤　含量：≥ 98%　规格：20 mg/支

6Benzyl Aminopurine　含量：≥ 98%　规格：20 mg/支

6羧二荧光素　含量：≥ 98%　规格：20 mg/支

6Carboxyfluorescein Diacetate　含量：≥ 98%　规格：20 mg/支

6羟多巴胺　含量：≥ 98%　规格：20 mg/支

6Hydroxydopamine Hydrobromide　含量：≥ 98%　规格：20 mg/支

异牡荆苷;Isovitexin with CAS号： 29702258 规格： 20mg 订购|咨询

右旋龙脑;Borneol CAS号： 507700 规格： 20mg 订购|咨询

油;cis9Octadecenoi CAS号： 112801 规格： 0.1ml 订购|咨询

酰缬草三;Acevaltratum CAS号：  规格： 20mg 订购|咨询

酰哈巴苷;8OAcetylharp CAS号： 6926143 规格： 20mg 订购|咨询

异型南五味子素;Heterocliti CAS号：  规格： 20mg 订购|咨询

洋艾素;Absinthin CAS号： 1362421 规格： 20mg 订购|咨询

α亚麻;alphaLinoleni CAS号： 463401 规格： 20mg 订购|咨询

龙脑;Bornyl acetate CAS号： 20347653 规格： 20mg 订购|咨询

亚麻;Gamma linolenic CAS号： 506263 规格： 20mg 订购|咨询

野漆树苷;Rhoifolin CAS号： 17306466 规格： 20mg 订购|咨询

叶黄制菌素;Xanthatin CAS号： 26791731 规格： 20mg 订购|咨询

3南美楝属二;Cabralea CAS号： 35833626 规格： 10mg 订购|咨询

酰二美味草素 A;Acetyldi CAS号： 94285220 规格： 10mg 订购|咨询

羽扇;Lupenone CAS号： 1617705 规格： 20mg 订购|咨询

Daminozide,99%小鼠蛋白激酶B(PKB) 进口/国产

Diphenylcarbazone,60%大鼠蛋白激酶B(PKB) 进口/国产

1-Acetyl-2-phenylhydrazine,≥98%人磷肌3激酶(PI3K) 进口/国产

Hydrazine dihydrochloride,≥98%小鼠磷肌3激酶(PI3K) 进口/国产

Benzoylhydrazine,98%大鼠磷肌3激酶(PI3K) 进口/国产

Maleic hydrazide,99%人白介素23(IL-23) 进口/国产

Isonicotinyl hydrazide,≥99%小鼠白介素23(IL-23) 进口/国产

2-Nitrophenylhydrazine,97%大鼠白介素23(IL-23) 进口/国产
转基因构建FMV启动子-PVY基因PCR试剂盒说明书福氏志贺氏菌种属: Shigella│flexneri提供形式: 冻干物安全等级: 2模式菌株: no应用领域: B　4a　IV　3,4...培养基: CM0051生长条件: 37℃存储条件: 真空冷冻干燥法

Talaromyces│sp.提供形式: 斜面培养物安全等级: 1模式菌株: no应用领域: 产生Glauconic acid or Glaucanic acid培养基: CM0018生长条件: 28C存储条件: -80℃冰箱冻结

Acetobacter│pasteurianus提供形式: 冻干物安全等级: 1模式菌株: no应用领域: 酿造食醋。培养基: CM0809生长条件: 30℃存储条件: 真空冷冻干燥法

Saccharomyces│cerevisiae提供形式: 斜面培养物安全等级: 1模式菌株: no应用领域: 舒氏日本面包酵母。培养基: CM0077生长条件: 28℃存储条件: 真空冷冻干燥法；定期移植法

Pisolithus│tinctorius (Pers.) Coker & Couch分离基物: 组织块提供形式: 斜面培养物安全等级: 1模式菌株: no培养基: 14生长条件: 25存储条件: 定期移植法

Rhizobium│loti Jarvis et al.分离基物: 大白拧条根瘤提供形式: 斜面培养物安全等级: 1模式菌株: no应用领域: 生物肥料培养基: 63生长条件: 29存储条件: 定期移植法

Phoma│glomerata (Corda) Wollenw. & Hochapfel分离基物: 枝干提供形式: 斜面培养物安全等级: 1模式菌株: no应用领域: 代谢产物培养基: 14生长条件: 25存储条件: 定期移植法

Paecilomyces│gunnii提供形式: 斜面培养物安全等级: 1模式菌株: no培养基: 14生长条件: 25℃存储条件: -80℃冰箱冻结法；矿物油法；定期移植法

Monilinia│fructicola (G. Winter) Honey分离基物: 自然果提供形式: 斜面培养物安全等级: 1模式菌株: no培养基: 14生长条件: 22－25存储条件: 定期移植法
标准操作步骤：

产品仅用于科研如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1.液氮充分研磨样品。

2.收集研磨成粉末的50mg样品，置于1.5ml离心管中。

3.加入350μl65℃预热的缓冲液IL，并加入20μl蛋白酶K剧烈地漩涡振荡，确保所有的组织团都分散均匀。

4.65℃水浴20-30min。水浴期间颠倒样品数次。

5.加入350μl氯仿，充分混匀，12,000 rpm(~13,400×g)离心5分钟。

6.小心地把上清液吸至另一新的1.5ml离心管中。注意确保不要打散沉淀团或把组织碎片也一起转移。

7.加入4μl RNase A，涡旋混匀。室温放置2min。

8.加入二分之一上清体积的缓冲液IB与等体积的无水乙醇，充分混匀。如：向300μl上清中加入150μl缓冲液IB与300μl无水乙醇。

9.把上述混匀的液体转移到吸附柱上。10,000×g离心1 min以结合DNA，弃去滤出液体。纯化柱*容量为750μl,如果混合液大于750μl,请分两次过柱。

10.将吸附柱重新套回收集管中，加入500μl缓冲液WB至柱子中，10,000×g离心1min,倒弃流出液；

11.将吸附柱重新套回收集管中，加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，10,000×g离心1min,倒弃流出液；

注意：DNA Wash Buffer使用前须按要求用无水乙醇稀释。如果放入冰箱中，使用前须恢复到室温。

12.再加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，8,000×g离心1min,弃去流出液；

13.将吸附柱重新套回2ml收集管中，*转速（>13000×g）离心空结合柱1min以干燥柱子的基质；这一步对下面的洗脱步骤至关重要。

14.将柱子置于1.5ml灭菌离心管，加入50-150μl65℃预热的洗脱缓冲液EB至柱子的膜中央。室温静置5min；

15. 室温下，离心(>13000)1min，以洗脱DNA。保留含DNA的流出液。将DNA储于-20℃。