产品特点：

◇高特异性：与其他病毒无交叉反应，无非特异性扩增；

◇高灵敏度：检测灵敏度可达10~100拷贝；

◇操作简便：该系列所有试剂均采用相同的体系和条件，可同时进行多个检测；

◇高通量：多种双重PCR检测以及三重PCR检测试剂盒。

参数规格：

产品名称：转基因品系马铃薯RBMT21-350探针法qPCR试剂盒说明书

货号：LZR85554

产品规格：50次

产品运输：低温运输

产品保存：-20℃保存

产品有效期：一年

产品特点：

产品仅用于科研本产品就是根据保守区设计引物而开发的高灵敏 PCR检测试剂盒 。

需要注意：

PCR反应液请在冰中配制，然后置于PCR反应仪上进行PCR反应。这种冷启动法（Cool Start Method）与热启动法（Hot Start Method）相结合，更能有效地减少PCR过程中的非特异性反应，增强PCR扩增的特异性，能得到良好的PCR结果。

PCR的反应条件：

因扩增片段的大小、反应体积、使用扩增仪器的不同而不同。

◇ 循环次数

根据模板DNA的量以及扩增片段的大小，设定25～30个循环。

如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，则会出现Smear。

◇ Anneal以及Extension

合适的Anneal温度通常在45～68℃之间 (预备实验可2℃间隔进行)。另外，由于在60～68℃间，也有很高的活性, 因此可在此温度范围内设定Anneal-Extension温度, 进行2 Step PCR。Anneal-Extension温度为68℃ 时，每kbp大体可设定30秒～1分钟；当温度设定在68℃以下时, 时间设定可稍长一些。通常，Anneal温度太高，有时会得不到扩增产物；Anneal温度太低时，容易发生非特异性反应。另外，Extension时间太短时，会得不到扩增产物或者会有一些短的非特异性产物优成；而Extension时间太长时，会出现Smear。

使用方法

一、样品 DNA 的制备

1.用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒DNAout。

2.如果有 N 个样品，则需要做 N+2 个提取，包括一个阳性对照和一个阴性对照。阳性对照是在 200μL 水中加 10μL PCR 阳性对照作为阳性对照，阴性对照是直接用 200μL 水作为阴性对照。提取结束后，*得到 200μL 模板 DNA（每个样品）放冰上待用，溶解 DNA 沉淀的溶液不能少于 200μL，否则PCR 抑制物很可能会抑制 PCR。二、PCR（60 μL 体系）

3.样品管：在 N+2 个PCR 管中加入下列成分：成分 N 个样品管 阴性对照 阳性对照PCR MagicMix 3.0 各 20 μL 20 μL 20 μL PCR 引物对 各 2 μL 2 μL 2 μL 样品 DNA 模板 各 18 μL - - 阳性对照（纯化后） - 18 μL - 阴性对照（纯化后） - - 18 μL电泳检测

4.取 10-20 μL PCR 产物直接进行琼脂糖凝胶电泳（本产品不需要单独加loading buffer），使用 100 bp DNA Marker，如果样品为阳性，将会得到长度为 3582 bp 的扩增产物。

二反应的准备： 　　

待各组份融化后先瞬时离心，然后轻弹混匀。按下表在已灭菌的PCR管中配制反应体系，每次实验需加一个阴性和一个阳性对照，测试反应管可以有多个。配制过程中应注意无菌，戴口罩，并注意避免操作产生的气溶胶造成样品间的交叉污染，推荐在有风压的设备如超净台或生物安全柜中进行操作。建议配制完毕后瞬时离心以使液体沉至管底。 　　

三、PCR反应： 　　

降落PCR法(Touchdown PCR)：94℃变性2分钟;首循环：94℃变性30秒，68℃退火30秒，72℃延伸45秒;八个循环开始，每循环退火温度下降1℃，其余不变;从第九个循环开始，反应条件固定为：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸45秒，循环32次;循环结束后，在72℃延伸7分钟，*保持在4℃。

标准操作步骤：

产品仅用于科研如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1.液氮充分研磨样品。

2.收集研磨成粉末的50mg样品，置于1.5ml离心管中。

3.加入350μl65℃预热的缓冲液IL，并加入20μl蛋白酶K剧烈地漩涡振荡，确保所有的组织团都分散均匀。

4.65℃水浴20-30min。水浴期间颠倒样品数次。

5.加入350μl氯仿，充分混匀，12,000 rpm(~13,400×g)离心5分钟。

6.小心地把上清液吸至另一新的1.5ml离心管中。注意确保不要打散沉淀团或把组织碎片也一起转移。

7.加入4μl RNase A，涡旋混匀。室温放置2min。

8.加入二分之一上清体积的缓冲液IB与等体积的无水乙醇，充分混匀。如：向300μl上清中加入150μl缓冲液IB与300μl无水乙醇。

9.把上述混匀的液体转移到吸附柱上。10,000×g离心1 min以结合DNA，弃去滤出液体。纯化柱*容量为750μl,如果混合液大于750μl,请分两次过柱。

10.将吸附柱重新套回收集管中，加入500μl缓冲液WB至柱子中，10,000×g离心1min,倒弃流出液；

11.将吸附柱重新套回收集管中，加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，10,000×g离心1min,倒弃流出液；

注意：DNA Wash Buffer使用前须按要求用无水乙醇稀释。如果放入冰箱中，使用前须恢复到室温。

12.再加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，8,000×g离心1min,弃去流出液；

13.将吸附柱重新套回2ml收集管中，转速（>13000×g）离心空结合柱1min以干燥柱子的基质；这一步对下面的洗脱步骤至关重要。

14.将柱子置于1.5ml灭菌离心管，加入50-150μl65℃预热的洗脱缓冲液EB至柱子的膜中央。室温静置5min；

15. 室温下，离心(>13000)1min，以洗脱DNA。保留含DNA的流出液。将DNA储于-20℃。
5,5-二巯基-2,2-二硝基苯甲酸实验步骤AceCS1 (D19C6) Rabbit mAb20 ul

比布里希猩红使用说明书AceCS1 (D19C6) Rabbit mAb100 ul

吖啶红保存WAVE-2 (D2C8) XP® Rabbit mAb20 ul

磺酰罗丹明B使用说明书WAVE-2 (D2C8) XP® Rabbit mAb1Kit

茜素蓝S保存FastScan™ Total Btk ELISA Kit100 ul

双向电泳指示剂使用说明书Glucocorticoid Receptor (D8H2) XP® Rabbit mAb20 ul

5（6）-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯价格Glucocorticoid Receptor (D8H2) XP® Rabbit mAb100 ul

蜜二糖使用说明书α-E-Catenin (D9R5E) Rabbit mAb300 ul

水苏糖实验步骤Phospho-Acetyl-CoA Carboxylase (Ser79) Antibody100 ul

葡糖酸内酯实验步骤Phospho-Acetyl-CoA Carboxylase (Ser79) Antibody100 ul

十二烷基-β-D-麦芽糖苷价格Acetyl-CoA Carboxylase Antibody100 ul

胆固醇乙酸脂价格RhoE (4) Mouse mAb100 ul

2-双（2-羟基）氨基-2-（羟甲基）-1,3-丙二醇盐酸盐实验步骤Annexin A7 Antibody100 ul

马铃薯淀粉实验步骤ALDH1A1 (D9J7R) XP®Rabbit mAb20 ul

癸基吡喃葡萄糖苷价格ALDH1A1 (D9J7R) XP®Rabbit mAb100 ul

维生素C钠使用说明书RCC2 Antibody100 ul

5-尿苷一磷酸二钠盐实验步骤p115 RhoGEF (D25D2) XP® Rabbit mAb100 ul
转基因品系马铃薯RBMT21-350探针法qPCR试剂盒说明书Steccherinum│rawakense (Pers.) Banker分离基物: 菌体提供形式: 斜面培养物安全等级: 1模式菌株: no培养基: 14生长条件: 25存储条件: 定期移植法

O1群霍乱弧菌种属: Vibrio│cholerae O1提供形式: 冻干物安全等级: 3模式菌株: no应用领域: O1/classical　稻叶(Inaba)培养基: CM0116生长条件: 37℃存储条件: 真空冷冻干燥法

Rhodotorula│mucilaginosa分离基物: 沉积物/深海沉积物提供形式: 冻干物安全等级: 1模式菌株: no应用领域: 大洋酵母培养基: 471生长条件: 10℃存储条件: 液氮超低温冻结法；-80℃冰箱冻结法；真空冷冻干燥法

Rhodoplanes│sp.分离基物: 水样/表层海水提供形式: 其它安全等级: 1模式菌株: no应用领域: 污染物降解培养基: 1004生长条件: 25-35℃存储条件: 液氮超低温冻结法；-80℃冰箱冻结法；真空冷冻干燥法

Armillaria tabescens提供形式: 斜面培养物安全等级: 1模式菌株: no应用领域: 药用培养基: CPDA：马铃薯煮液 1.0L，葡萄糖 20.0g，KH2PO4 3.0g，MgSO4·7H2O 1.5g，维生素B1 微量，琼脂 20.0g，pH 6.0±0.2。121℃，15min灭菌。马铃薯煮液：称取200g去皮的马铃薯块，沸水煮30min，收集滤液定容至1.0L。生长条件: 25-28℃,6天，好氧存储条件: 液氮超低温冻结法;真空冷冻干燥法

Bacillus│natto提供形式: 斜面培养物安全等级: 1模式菌株: no培养基: 33生长条件: 37℃存储条件: 真空冷冻干燥法

Aspergillus│usamii提供形式: 冻干物安全等级: 1模式菌株: no应用领域: 糖化菌培养基: CM0014生长条件: 25-28℃存储条件: 真空冷冻干燥法

Bacillus│marisflavi分离基物: 沉积物/海底沉积物提供形式: 冻干物安全等级: 1模式菌株: no应用领域: 无机污染物抗性菌/抗六价铬Cr培养基: 472生长条件: 28℃存储条件: 液氮超低温冻结法；-80℃冰箱冻结法；真空冷冻干燥法

Escherichia│coli提供形式: 冻干物安全等级: 1模式菌株: no应用领域: 遗传研究；大肠杆菌素E1质体培养基: 0032生长条件: 37℃存储条件: 液氮超低温冻结法;真空冷冻干燥法