参数规格：

产品名称：转基因品系烟草C/F/93/08-02 PCR试剂盒规格

货号：LZR85704

产品规格：50次

产品运输：低温运输

产品保存：-20℃保存

产品有效期：一年

产品特点：

产品仅用于科研本产品就是根据保守区设计引物而开发的高灵敏 PCR检测试剂盒 。

产品特点：

◇高特异性：与其他病毒无交叉反应，无非特异性扩增；

◇高灵敏度：检测灵敏度可达10~100拷贝；

◇操作简便：该系列所有试剂均采用相同的体系和条件，可同时进行多个检测；

◇高通量：多种双重PCR检测以及三重PCR检测试剂盒。

需要注意：

PCR反应液请在冰中配制，然后置于PCR反应仪上进行PCR反应。这种冷启动法（Cool Start Method）与热启动法（Hot Start Method）相结合，更能有效地减少PCR过程中的非特异性反应，增强PCR扩增的特异性，能得到良好的PCR结果。

PCR的反应条件：

因扩增片段的大小、反应体积、使用扩增仪器的不同而不同。

◇ 循环次数

根据模板DNA的量以及扩增片段的大小，设定25～30个循环。

如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，则会出现Smear。

◇ Anneal以及Extension

合适的Anneal温度通常在45～68℃之间 (预备实验可2℃间隔进行)。另外，由于在60～68℃间，也有很高的活性, 因此可在此温度范围内设定Anneal-Extension温度, 进行2 Step PCR。Anneal-Extension温度为68℃ 时，每kbp大体可设定30秒～1分钟；当温度设定在68℃以下时, 时间设定可稍长一些。通常，Anneal温度太高，有时会得不到扩增产物；Anneal温度太低时，容易发生非特异性反应。另外，Extension时间太短时，会得不到扩增产物或者会有一些短的非特异性产物优成；而Extension时间太长时，会出现Smear。

使用方法

一、样品 DNA 的制备

1.用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒DNAout。

2.如果有 N 个样品，则需要做 N+2 个提取，包括一个阳性对照和一个阴性对照。阳性对照是在 200μL 水中加 10μL PCR 阳性对照作为阳性对照，阴性对照是直接用 200μL 水作为阴性对照。提取结束后，*得到 200μL 模板 DNA（每个样品）放冰上待用，溶解 DNA 沉淀的溶液不能少于 200μL，否则PCR 抑制物很可能会抑制 PCR。二、PCR（60 μL 体系）

3.样品管：在 N+2 个PCR 管中加入下列成分：成分 N 个样品管 阴性对照 阳性对照PCR MagicMix 3.0 各 20 μL 20 μL 20 μL PCR 引物对 各 2 μL 2 μL 2 μL 样品 DNA 模板 各 18 μL - - 阳性对照（纯化后） - 18 μL - 阴性对照（纯化后） - - 18 μL电泳检测

4.取 10-20 μL PCR 产物直接进行琼脂糖凝胶电泳（本产品不需要单独加loading buffer），使用 100 bp DNA Marker，如果样品为阳性，将会得到长度为 3582 bp 的扩增产物。

二反应的准备： 　　

待各组份融化后先瞬时离心，然后轻弹混匀。按下表在已灭菌的PCR管中配制反应体系，每次实验需加一个阴性和一个阳性对照，测试反应管可以有多个。配制过程中应注意无菌，戴口罩，并注意避免操作产生的气溶胶造成样品间的交叉污染，推荐在有风压的设备如超净台或生物安全柜中进行操作。建议配制完毕后瞬时离心以使液体沉至管底。 　　

三、PCR反应： 　　

降落PCR法(Touchdown PCR)：94℃变性2分钟;首循环：94℃变性30秒，68℃退火30秒，72℃延伸45秒;从八个循环开始，每循环退火温度下降1℃，其余不变;从第九个循环开始，反应条件固定为：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸45秒，循环32次;循环结束后，在72℃延伸7分钟，*保持在4℃。

人β-内啡肽Elisa Kit说明书OX40 (E9U7O) XP® Rabbit mAb100 ul

人白介素-5Elisa Kit图片Syk (4D10) Mouse mAb (PE Conjugate)100 ul

人分泌型免疫球蛋白AElisa Kit*钱Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control100 ul

人牛血清白蛋白Elisa Kit图片SET1A (D3V9S) Rabbit mAb100μl

人桥粒芯糖蛋白-1 Elisa Kit图片TREM2 (E6T1P) Rabbit mAb (Amino-terminal Antigen100 ul

人乳铁蛋白Elisa Kit品牌β-Tubulin (9F3) Rabbit mAb (Biotinylated)100 ul

人肾损伤分子-1Elisa Kit说明书Caspr2 (D6S1O) Rabbit mAb10 ug

人脂多糖Elisa Kit品牌Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2)100 ul

小鼠B细胞活化因子Elisa Kit品牌SIGMAR1 (D4J2E) Rabbit mAb100 ul

小鼠白介素-3Elisa Kit品牌Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) (E2R1O) Mouse mAb60 ul

小鼠蛋白CElisa Kit图片SignalSilence® Control siRNA (Fluorescein Conjugate)300 ul

小鼠纤溶酶原激活剂抑制物Elisa Kit图片SignalSilence® ILK1 siRNA I300 ul

犬S-100蛋白Elisa Kit说明书SignalSilence® c-Jun siRNA I100 ul

兔降钙素基因相关肽Elisa Kit图片TRBP2 (D7C8K) Rabbit mAb300 ul

兔血红蛋白Elisa Kit说明书SignalSilence® c-Jun siRNA II300 ul

兔游离胆固醇Elisa Kit图片SignalSilence® YB1 siRNA I300 ul

真菌 RNAout250 次*钱SignalSilence® YB1 siRNA II1Kit
转基因品系烟草C/F/93/08-02 PCR试剂盒规格Streptomyces│sp.分离基物: 土壤提供形式: 冻干物安全等级: 1模式菌株: no培养基: 0012生长条件: 28℃存储条件: 液氮超低温冻结法;真空冷冻干燥法

Salegentibacter│mishustinae分离基物: 沉积物/土灰色沉积物20-22cm提供形式: 冻干物安全等级: 1模式菌株: no应用领域: 1、海洋石油污染生物修复； 2、生物活性物质筛选。培养基: 821生长条件: 28℃存储条件: 液氮超低温冻结法；-80℃冰箱冻结法；真空冷冻干燥法

Nocardioides│marinus分离基物: 水样/深层海水提供形式: 冻干物安全等级: 1模式菌株: no应用领域: 1.生物降解；2.生物催化；3.生物活性物质筛选；4.海洋微生物生态学研究。培养基: 471生长条件: 25℃存储条件: 液氮超低温冻结法；-80℃冰箱冻结法；真空冷冻干燥法

Bacillus│sp.分离基物: 沉积物/海滩沉积物提供形式: 冻干物安全等级: 1模式菌株: no应用领域: 近海细菌培养基: 33生长条件: 25℃存储条件: 液氮超低温冻结法；-80℃冰箱冻结法；真空冷冻干燥法

Thalassospira│lucentensis分离基物: 沉积物/深海沉积物提供形式: 斜面培养物模式菌株: no应用领域: 大洋细菌培养基: 471生长条件: 25℃存储条件: 液氮超低温冻结法；-80℃冰箱冻结法；真空冷冻干燥法

Acinetobacter│lwoffii分离基物: 土壤提供形式: 冻干物安全等级: 1模式菌株: no培养基: 820生长条件: 20℃存储条件: 真空冷冻干燥法

膜醭毕赤酵母种属: Pichia│membranifaciens提供形式: 冻干物安全等级: 1模式菌株: no培养基: 0013生长条件: 25-28℃存储条件: 液氮超低温冻结法;真空冷冻干燥法

Pseudomonas│pachastrellae分离基物: 水样/上层海水提供形式: 冻干物安全等级: 1模式菌株: no应用领域: 潜在石油烃类降解菌/生物活性物质筛选培养基: 472生长条件: 25℃存储条件: 液氮超低温冻结法；-80℃冰箱冻结法；真空冷冻干燥法

Aspergillus│sulphureus提供形式: 冻干物安全等级: 1模式菌株: no培养基: 0015生长条件: 25-28℃存储条件: 液氮超低温冻结法;真空冷冻干燥法
标准操作步骤：

产品仅用于科研如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1.液氮充分研磨样品。

2.收集研磨成粉末的50mg样品，置于1.5ml离心管中。

3.加入350μl65℃预热的缓冲液IL，并加入20μl蛋白酶K剧烈地漩涡振荡，确保所有的组织团都分散均匀。

4.65℃水浴20-30min。水浴期间颠倒样品数次。

5.加入350μl氯仿，充分混匀，12,000 rpm(~13,400×g)离心5分钟。

6.小心地把上清液吸至另一新的1.5ml离心管中。注意确保不要打散沉淀团或把组织碎片也一起转移。

7.加入4μl RNase A，涡旋混匀。室温放置2min。

8.加入二分之一上清体积的缓冲液IB与等体积的无水乙醇，充分混匀。如：向300μl上清中加入150μl缓冲液IB与300μl无水乙醇。

9.把上述混匀的液体转移到吸附柱上。10,000×g离心1 min以结合DNA，弃去滤出液体。纯化柱*容量为750μl,如果混合液大于750μl,请分两次过柱。

10.将吸附柱重新套回收集管中，加入500μl缓冲液WB至柱子中，10,000×g离心1min,倒弃流出液；

11.将吸附柱重新套回收集管中，加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，10,000×g离心1min,倒弃流出液；

注意：DNA Wash Buffer使用前须按要求用无水乙醇稀释。如果放入冰箱中，使用前须恢复到室温。

12.再加入600μl DNA Wash Buffer至柱子中，8,000×g离心1min,弃去流出液；

13.将吸附柱重新套回2ml收集管中，*转速（>13000×g）离心空结合柱1min以干燥柱子的基质；这一步对下面的洗脱步骤至关重要。

14.将柱子置于1.5ml灭菌离心管，加入50-150μl65℃预热的洗脱缓冲液EB至柱子的膜中央。室温静置5min；

15. 室温下，离心(>13000)1min，以洗脱DNA。保留含DNA的流出液。将DNA储于-20℃。