L-型电压依赖型钙通道β抗体免疫荧光技术的实验步骤

L-型电压依赖型钙通道β抗体免疫荧光技术的实验步骤：

一、准备好试剂与仪器：

磷酸盐缓冲盐水、荧光标记的抗体溶液、缓冲甘油、搪瓷桶三只、有盖搪瓷盒一只、荧光显微镜、玻片架、滤纸、37℃温箱等。

二、实验步骤

1.滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，十分钟后弃去，使标本保持一定湿度。

2.滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间以三十分钟为参考。

3.取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸三到五分钟，并不停地摇晃振荡。

4.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

5.立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度。

   

抗体分子标记技术：

（一）原理

当应用化学氧化法时(NaI)遇强氧化剂,离子被氧化为分子,所生成的自由分子可与某些基团进行卤化反应。蛋白质分子可进行卤化反应的基团主要为酪氨酸残基,某些组氨酸残基也可能进行化。在应用胺T( Chloramine T)法的实验中,所用的氧化剂(1,3,4,6- tetrachloro-3a,6adipheny l-glucoluril)强挥发性的有机溶剂中。该溶剂加入试管后,先让其挥发(即让氧化剂将试管包被),然后把Na125I和蛋白质液加入包被好的试管中,反应完成即将混合液移入他管终止反应。

（二）准备

1.试剂

经亲和层析纯化的多克隆抗体或单克隆抗体；0.5mol/L磷酸钠缓冲液,pH7.5；无载体的Na125I3.7GBq/ml(100mCi/ml)的NaOH液；100g/L三醋酸；70%乙醇；新鲜制备的含2mg/m1络胺T的0.5mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5）；胺T反应终止缓冲液；

2.仪器

凝胶过滤柱；￥-记数器；玻璃纤维滤。

（三）操作要点

1.用胺T法进行化,也可在大约pH7.0的缓冲液中进行；

2.如果氧化反应损伤蛋白质，可将抗体与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联)胺T量减少到0.02mg/m，并将偏重亚硫酸液的浓度降到0.024mg/ml；

3. Iodogen-包被的试管可在干燥器中,于室温下保存多年；

4.1251标记的抗体,在制备后六周内均可使用(1251的半衰期为59.6天）；

5.要注意保证所用的Na1251是新鲜的,陈旧制剂的比活性低；

6.酪氨酸的碘化偶尔会对抗原的抗体结合位点有干扰,因此降低其结合能力,但这种情况很少见。
293(人胚肾细胞)
5637(人膀胱癌细胞)
293A (人胚肾细胞)
22RV1(人前列腺癌细胞)
293T(人胚肾细胞)
3T3-L1(小鼠胚胎成纤维细胞)
4T1(小鼠乳腺癌细胞)
6T-CEM (人T细胞白血病细胞)
769-P(人肾细胞腺癌细胞)
786-O(人肾透明细胞癌细胞)
95-D(人高转移肺癌细胞)
A172(人脑胶质瘤细胞)
A2780(人卵巢癌细胞)
A-375(人恶性黑色素瘤细胞)
A-431(人表皮癌细胞)
A549(人非小细胞肺癌细胞)
A673(人横纹肌瘤细胞)
A9(小鼠皮下结缔组织细胞)
AAV-293(人胚肾细胞)
Acc-2(人涎腺腺样囊性癌细胞)
ACHN(人肾癌细胞)
AGS(人胃腺癌细胞)
Ana-1(小鼠巨噬细胞)
Anglne(人卵巢癌细胞)
AR42J(大鼠胰腺外分泌细胞)
ARPE-19(人视网膜上皮细胞)
AsPC-1(人胰腺癌细胞)
AtT-20(小鼠垂体瘤细胞)
B16(小鼠黑色素瘤细胞)
Bcap-37(人乳腺癌细胞)
BEL-7402(人肝癌细胞)
BEL-7404(人肝癌细胞)
BGC823(人胃癌细胞)
BHK-21(仓鼠肾细胞)
BIU-87(人膀胱癌细胞)
BRL-3A(大鼠正常肝细胞)
BNL CL.2(小鼠胚胎肝细胞)